上面提到的抽血检查前列腺特异性抗原（PSA）和肛门指检都不能确诊前列腺癌，对于怀疑患前列腺癌的人，需要进行前列腺穿刺活检来确诊。
现代穿刺技术确诊性大幅进步
穿刺活检时医生需要插入一种称之为超声探头的医疗器械到检查者肛门内，医生通过超声清楚地观察到前列腺的形态和结构，然后超声引导下采用穿刺活检针穿刺前列腺，获取的少量前列腺组织条，制成切片放到显微镜下检查，医生根据显微镜下观察到的前列腺组织细胞形态来判断有没有癌（这种医生称之为病理医生），病理医生还要判断是哪一种类型的癌，大部分癌为前列腺腺癌，很少部分是其他类型或由身体其它器官转移癌。
随着穿刺技术的提高，现代的穿刺技术准确性有了大幅度的进步，我们甚至可以根据磁共振检查中发现的可疑位置进行空间定位，导航穿刺针在特定的部位“捉”到癌细胞，这样就能更好的在很早期使前列腺癌获得确诊。
对于前列腺癌，病理医生一般会对癌的恶性程度进行评分，医学上称之为Gleason评分，分数范围为2-10分，评分越高肿瘤恶性程度越高，临床上诊断的前列腺癌几乎都在5-10分的范围，5-6为低度恶性，7分为中度恶性，8-10分为高度恶性。
良性前列腺增大可能发展为癌
有些男性抽血检查前列腺特异性抗原（PSA）和肛门指检都没有异常，在做一种切除部分前列腺的手术后意外发现前列腺癌。随着年龄增长，大部分男性会出现前列腺良性增大，医学上称之为“良性前列腺增生”，其中部分男性前列腺明显增大，压迫尿道，影响尿液从膀胱排出，出现排尿困难，这种情况下往往需要做手术切除部分前列腺，解除对尿道的压迫，达到通畅排尿的目的。医生常规会将切除的这部分前列腺做病理检查（制成切片由病理医生在显微镜下检查），有的时候病理检查意外诊断为前列腺癌。幸运的是，这些病人往往处于早期，预后很好。
有些病人是因为有排尿困难、腰背痛或者骨痛等不舒服（这些症状在前文有提到，已不是早期）时到医院就诊，医生进行肛门指检和抽血检查前列腺特异性抗原（PSA）后，考虑有患前列腺癌的可能，然后做前列腺穿刺活检确诊为前列腺癌，这种情况发现的前列腺癌相当多的为中晚期，短期内分泌治疗效果很好，但长期治疗效果欠佳。
不能依赖单一的磁共振检查结果
另外，B超、磁共振（MRI）和核素骨扫描也可作为在PSA检出有患前列腺癌可能后的进一步诊断，但需要注意的是，虽然磁共振也在前列腺癌的检出中具有很大的使用价值，但其对医院、对机器和医生的要求都比较高，因为磁共振是一项非常复杂的检查，里面涉及到几十个参数的调整，不同的参数调整会直接影响到“探测”前列腺癌的灵敏度。由于检查参数设置的不适合，可能对前列腺癌造成误诊，所以不要只依赖某一次磁共振检查的结果。
