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2021年 4月 20日，清华大学药学院陈立功课题组在Cell Reports在线发表了题为“SLC22A14 is a mitochondrial riboflavin transporter required for sperm oxidative phosphorylation and male fertility”的研究论文，揭示了机械门控SLC22A14是作为精子细胞特异性的转运蛋白，可以通过转运核黄素调节长链脂肪酸β-氧化，从而维持精子内的能量稳态，其表达缺陷参与雄性不育疾病的发生。
不孕不育是一种非常普遍的疾病，影响着全球约7000万人的生活。据世界卫生组织（WHO）统计，目前全世界的育龄夫妇中约有9%在与生育问题作斗争，其中男性因素占约50%。少、弱精症或畸形精子症的高发是男性不育的主要原因，男性精子的质量呈逐年下降的趋势已经变成一项世界性的问题。
溶质载体（SLC）转运蛋白家族是人类基因组中第二大膜蛋白家族，是细胞内最大的一类转运蛋白家族，可以分布在细胞内从核膜到细胞质膜的各种生物膜结构上。SLC 易感位点已被发现与多种代谢性疾病有强烈相关性，这些疾病包括胰岛素抵抗、2 型糖尿病、高血压、慢性肾病、痛风、哮喘、炎症性肠病、癌症、痴呆和焦虑症等。SLC22A14是在哺乳动物中进化保守的SLC22亚家族成员，特异性地表达在雄性生殖细胞中。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建了Slc22a14 基因敲除的小鼠，发现发现雄性纯合子敲除小鼠是不育的，然而SLC22A14 的生物学功能和底物却完全未知，其致病机制尚不清楚。
作者首先利用CASA 系统和体外受精试验分析发现了Slc22a14 敲除引发精子的运动能力严重受损，致使精子无法穿透透明带使卵母细胞受精。进一步研究发现Slc22a14 KO精子ATP水平显著降低，证实Slc22a14在某种程度上参与了精子的能量代谢。精子的运动主要依靠鞭毛主段的摆动产生助推作用，而鞭毛主段富含糖酵解酶类，因此一直以来，精子尾部的糖酵解被认为是人类和小鼠精子运动的主要能量来源。然而，越来越多的证据表明脂肪酸代谢在精子能量生成中的重要性。
针对附睾尾部精子的代谢组学和脂质组学分析表明Slc22a14敲除的精子内长链脂肪酸氧化和TCA 循环的中间代谢物显著减少，并且发生了长链游离脂肪酸和甘油三酯的蓄积，而糖酵解过程发生代偿性升高，但仍不能弥补ATP生成的不足。作者接下来采用放射性和非放射性同位素示踪技术，检测了碳同位素标记的葡萄糖和脂肪酸底物在精子内的代谢情况，同时利用能量代谢分析仪评估了精子细胞耗氧量和胞外产酸值的变化，最终证实Slc22a14 敲除的精子内长链脂肪酸β-氧化（FAO）和氧化磷酸化（OXPHOS）途径均存在缺陷，并且糖脂氧代谢途径发生了重编程。作者发现，游离脂肪酸约占精子内总脂质含量的25%，并且多种FAO相关蛋白质在精子内呈高丰度表达，而尽管FAO产ATP的量只占正常精子ATP生成总量的30%，但它对精子的运动和生育能力是不可或缺的。
作为一个转运蛋白，SLC22A14的细胞内定位是什么以及通过转运何种底物来发挥作用的呢？作者利用蛋白质质谱分析技术和超高分辨率显微成像技术发现，SLC22A14是定位于精子线粒体内膜的转运蛋白。精子是高度特化的一类细胞，无法大量体外扩增，并且在体外存活时间短，很难分离出有活性的线粒体。因此，作者采用SLC22A14过表达稳定细胞系作为研究模型，结合线粒体代谢组学、放射性或非放射性同位素标记底物摄取实验以及核黄素缺乏的小鼠模型，鉴定出了核黄素为SLC22A14的底物之一。核黄素是FMN和FAD的前体，是FAO、TCA 循环、ETC 复合物I 和II 的辅因子。此外，作为抗氧化剂，核黄素还可以保护细胞免受氧化损伤。Slc22a14基因敲除干扰核黄素进入线粒体基质的运输过程，导致FMN和FAD耗竭和黄素酶活性降低，从而抑制ATP的合成，诱发精子功能损伤以及雄性不育。
该研究首次对精子这一特殊细胞类型的能量代谢展开较为系统的研究，填补了精子能量代谢领域和线粒体核黄素转运蛋白研究领域的部分空白。一方面，作为精子特异性表达的转运蛋白，SLC22A14 可以潜在地应用到以控制精子代谢为靶标的男性避孕药的开发；另一方面，对SLC22A14 的研究可为临床男性不育诊治提供理论依据。
清华大学药学院陈立功研究员为本文的通讯作者。药学院已毕业博士生匡文华为本文第一作者。实验室成员张杰、兰洲、马志龙、程丽丽、赵心彬、罗琪和孟子裔，新加坡A*STAR研究所范昊研究员、中科院动物所李卫研究员、清华大学医学院纪家奎研究员等为本项研究工作做出了重要贡献。此项工作得到比尔盖茨基金会、科技部重点研发计划、基金委重大研究计划和北京市结构生物学高精尖创新中心的基金支持。
作者专访
Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者陈立功研究员代表团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：SLC22A14在此前的雄性生殖方面都有哪些研究，同时又有哪些尚未阐明的问题呢？
陈立功研究员：Slc22a14基因部分位于第九号染色体上一个名为Oligotriche（Olt）的全长234kbp的基因簇上。Olt包含Vill、Plcd1、Dlec1、Acaa1b等基因的完整基因片段以及Ctdspl、Slc22a14的部分片段。最早Mutier等人发现Olt突变能够引起小鼠的毛发稀疏现象。后来Chubb与Cunningham等人在1992和1998年相继发现，这种突变的遗传方式是隐性的，突变引起的表型在雄鼠和雌鼠之间没有性别差异；尽管如此，Olt缺失突变的纯合子雄鼠与雌鼠在生育力上却有着巨大差异——纯合子雄鼠是不育的，而纯合子雌鼠却有着正常的生育力；研究人员还发现该基因簇的缺失在精子发育过程中会导致精子的尾部缺陷。2008年，Fabian Runkel等人研究发现，小鼠Olt基因簇中的Plcd1基因缺失能够引起和Olt缺失相似的毛发稀疏现象，然而生育能力却没有受到影响。此外，2016年，Maruyama等人对SLC22A14的生理功能做了初步研究，阐明了SLC22A14敲除引发雄性不育的现象，并且认为SLC22A14是特异性地表达在精子上的蛋白，然而，对SLC22A14在亚细胞层面更精细的定位以及SLC22A14的底物等核心问题，并没有做出进一步的阐明。
CellPress：氧化磷酸化对于精子而言有何重要意义？
陈立功研究员：以往研究表明，根据底物的可得性，精子的能量主要来自糖酵解（Glycolysis）和氧化磷酸化（OXPHOS）两种代谢途径生成的ATP。精子对能量代谢方式的选择主要有两方面的特点。一方面，不同发育时期的精子细胞，代谢途径选择的侧重有所不同，成熟时期的精子主要依赖糖酵解方式供能(Bajpai et al., 1998)。另一方面，精子细胞的不同部位对代谢途径的选择也有差别。糖酵解途径主要发生鞭毛的纤维鞘内，因为糖酵解酶类紧密地沿着纤维鞘分布在鞭毛主段。而氧化磷酸化途径位于线粒体鞘，线粒体只特异性地局限在鞭毛中段分布。
精子的运动主要依赖鞭毛尾段的摆动，这一段是ATP 的主要消耗部位。糖酵解酶类被发现主要位于鞭毛尾段的纤维鞘上，也就是离ATP 消耗的部位最近的部位。鉴于以上事实，以往的研究大多数都集中在糖酵解途径上，因此有研究人员认为它是哺乳动物精子能量的主要来源。
对于氧化磷酸化，一个主要的争议点在于，由鞭毛中段的线粒体生成的ATP能否快速有效地传递到整个鞭毛尾段(Mukai and Travis, 2012)。即便如此，亦有很多证据表明，在体积如此小的精子细胞内，ATP 从线粒体鞘到鞭毛尾段的迁移是足够快速且有效的(Ford, 2006)。更加值得注意的是，线粒体的膜电势也被证明与精子的活动力与受精能力紧密相关。也就是说，无论糖酵解还是氧化磷酸化，都可以作为精子的能量供应途径。
此外，糖酵解途径的主要底物是葡萄糖，无氧条件下生成丙酮酸或乳酸；氧化磷酸化途径的底物更加多样化，代表性的有由碳水化合物、脂类和蛋白质分解代谢而衍生的不同分子。鉴于以上事实，我们认为，糖酵解和线粒体氧化磷酸化并不是以往文献中经常报道的可相互替代的产能途径。比如当考虑到葡萄糖的完全有氧氧化时，第一个途径就是第二个途径的前期过程。
CellPress：长链脂肪酸b-oxidation (FAO)在精子成熟过程中发挥怎样的功能？
陈立功研究员：精子的运动主要依靠鞭毛主段的摆动产生助推作用，而鞭毛主段符号糖酵解酶类，因此精子尾部的糖酵解被认为是人类和小鼠精子运动的主要能量来源。然而，越来越多的证据表明脂肪酸代谢在精子能量生成中的重要性。与对糖酵解代谢产物的观察结果相反，我们发现Slc22a14 KO 精子中许多种类的长链酰基肉碱显著减少。对精子脂质组学的分析表明，游离脂肪酸约占总脂质的25%；蛋白质组学数据显示，精子内有FAO 相关的多种蛋白质，并且有较高丰度。这些发现再次有力地支持了脂肪酸确实被精子用作能量源的推测。先前的研究表明，精子内大脂滴的聚集导致人和小鼠的雄性不育，这也与某些脂质代谢缺陷有关。精子运动能力低表现出与饱和脂肪酸富集的相关性。我们对附睾尾部精子的脂质组学分析发现，FFA和TAGs 在Slc22a14 KO 精子中都有明显的积累，我们推断这些脂肪酸水平升高很可能是FAO 活性降低的结果。我们发现，尽管FAO 产ATP 量只占正常精子ATP 生成量的30%，但它对精子的运动和生育能力是不可或缺的。哺乳动物精子携带的糖原含量非常低（如果有的话），因此，在没有细胞外碳水化合物的情况下，精子只能利用内源性脂质的彻底氧化来供能。我们的结果也支持了这一观点，即尽管糖酵解作用是精子中主要的ATP 生成途径，但Slc22a14 介导的FAO 确实在精子能量供应系统中发挥作用。因此，将来针对精子的研究在设计实验或模拟精子生理环境时应当考虑到精子这一能量产生来源的影响。
CellPress：SLC22A14在精子中的定位是怎样的？这种定位具有怎样的生物学意义？
陈立功研究员：本研究结合了外源性表达、内源性检测、免疫荧光以及靶向质谱分析等多种策略确定了SLC22A14蛋白特异性地表达细胞线粒体内膜上。
线粒体是细胞的“能量工厂”，它是由双层膜即内膜和外膜构成的细胞器。内膜较为光滑，面积较小，而外膜向内弯曲成嵴状，面积较大。线粒体的外膜成分与一般生物膜类似，蛋白质和脂类成分各占50%左右。外膜通透性较大，5000Da以下的分子一般可直接通过外膜， 大于5000Da 的分子通过外膜转运酶（Translocase of outer membrane，TOM）进行跨外膜运输。而线粒体内膜所含的蛋白质的比例远高于外膜，细胞色素c 氧化酶（Cytochrome c oxidase，COX）等电子传递链酶复合物以及ATP 合成的酶类是内膜的主要成分；内膜上还包含多种转运蛋白，可以介导小分子代谢物、辅因子以及核苷酸等多种物质的跨内膜转运，因此线粒体内膜通透性较低。鉴于线粒体内外膜的组成成分以及功能行使上存在的巨大差别，我们有理由从细胞水平、亚细胞水平甚至到亚细胞器水平来细化SLC22A14的精细定位。
CellPress：在探究核黄素转运缺乏的影响时，研究了遗传、生化、运动、营养等多个方面，请您谈一下这样多方面研究的优势。
陈立功研究员：首先我们需要确定核黄素缺乏模型是否成功构建以及其合理性。高等动物体内不能通过内源合成核黄素，必须通过饮食从外界摄取。核黄素进入细胞后必须换转变成FMN 和FAD 才能发挥生物学作用。FMN 和FAD 是核黄素在体内的活性型，它们作为细胞内多种氧化还原酶辅基，参与生物体内的多种氧化还原反应，包括脂肪酸的β-氧化过程以及线粒体呼吸链中的电子传递过程。
由于核黄素广泛存在于动物或植物的组织中并且与多种营养素有相互作用，因此普通的饲料不适合用来制作核黄素缺乏的模型饲料，所以我们最终采用的是纯化原料配制成的纯化型模型饲料。饲料配方是基于美国营养学会制定的AIN93M 标准生产的，只含有极微量（酪蛋白中）的核黄素。
另外，前文我们提到过，核黄素对生命活动的正常运行起到非常关键的作用。幼年核黄素缺乏会引起动物生长迟滞、脱毛、皮肤炎症、运动失调甚至死亡，会直接影响实验结果的可靠性，因此对小鼠初始喂养年龄以及周期的选择至关重要。我们最终选用了成年的6 周龄雄鼠，于金属笼（无植物性垫料）进行为期8周的核黄素缺乏饲料的喂养。之所以选取该时间段，是由于此阶段属于小鼠的成年到壮年时期，生育力以及精子的生成是非常活跃的，适于做精子生成和发育的相关检测，并可以排除由于生理因素引起的影响。另外8 周的饲养还未引起明显的皮肤和毛发等全身性病变（严重核黄素缺乏症状），因此这样的选择可以最大限度排除年龄和其他机体病变对生育力的影响。
其次，Slc22a14 敲除可以导致精子的结构和功能均出现明显异常，因此需要进行多方位的检测，以确定这些变化是由精子核黄素缺乏引起。
CellPress：您认为本研究的成果能够在男性生殖方面提供怎样的指导？
陈立功研究员：精子是高度特化的一类细胞，体外存活时间段，无法大量扩增；精子线粒体是高度浓缩的月牙状结构，高度有序紧密排列并包绕在精子鞭毛的中部，形成线粒体鞘。精子整体以及线粒体结构的独特性致使以往的研究中，生殖学家们鲜有人对精子代谢，尤其是线粒体的功能展开详细深入的探索。我们已经知道，脂肪酸的β-氧化经由OXPHOS 产生ATP 这一过程在心脏和肾脏等器官的能量供应中是必不可少的途径。然而，很少有研究阐明精子脂肪酸代谢在精子质量和男性生育能力中的作用, 相关的调节因子对精子能量产生的具体作用尚待完全确定。该研究首次对精子这一特殊细胞类型的能量代谢展开较为系统的研究，提出并证实了脂肪酸β-氧化是精子成熟期的重要能量来源，填补了精子能量代谢研究领域的部分空白。
此外，本论文阐明了SLC22A14 在雄性不育中的作用，利用多组学技术、高分辨成像技术、蛋白质谱分析和同位素底物摄取实验深入挖掘了其生理功能和致病机理，为理解认识雄性不育和诊断治疗男性生殖疾病提供了依据。其次，由于Slc22a14的敲除只特异性地影响雄性小鼠的生育能力，因此，针对SLC22A14 的研究还有可能对男性避孕药的开发提供了可能的药物靶点。由于常用避孕药具采用基于女性生殖生理学的模式，因此导致一种强烈的偏见，即认为妇女只负责生育管理，在避孕问题上，她们首当其冲地受到药物副作用的影响（Amory，2020）。男性避孕药的发展现在被广泛认为是避孕的一个未得到满足的需求（Matzuk，2012）。我们的工作可以在一定程度上引导读者认识了解男性避孕药，也许可以为后续研究者筛选针对SLC22A14 的特异性抑制剂提供理论和数据支持。
研究员
清华大学药学院研究员，本科毕业于南开大学化学系，分别于美国加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校获得博士和博士后训练。主要研究重要SLC转运蛋白的生理和药理功能，发现了多种转运蛋白的内源性底物以及他们在代谢性疾病、癌症和免疫系统中的代谢调控和致病机理, 为这些疾病治疗提供了潜在的药物靶点和新的治疗策略。目前已发表论文近50篇，多项研究成果以通讯作者/共同通讯身份发表在 Immunity, Gut, Hepatology, Nature Communications, Cell Reports, Cell Death and Differentiation和PLOS Biology等国际知名期刊上。他的研究成果曾被多家国际媒体作为亮点报道，其中包括Science, F1000和Scientific American等。他曾获得多个奖项，包括国家“万人计划”中青年科技创新领军人才、药明康德生命化学奖、清华大学优秀教学奖、拜耳研究员奖、杨森研究员奖等。
相关论文信息
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▌论文标题：
SLC22A14 is a mitochondrial riboflavin transporter required for sperm oxidative phosphorylation and male fertility
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00339-9
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109025
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