草鱼感染GCRV后,各脏器小血管内皮受损严重,引起弥散性血管内凝血并形成微血栓,导致循环血量减少,正常代谢功能障碍,最终导致脏器组织病变。草鱼出血病的发病季节长、流行范围广,每年6月中下旬至9月底是主要流行季节,流行高峰一般出现在7月和9月,死亡率高。高密度饲养的鱼种池危害更甚,常造成全池鱼死亡。按病鱼的症状,草鱼出血病大致可分为红鳍红鳃盖型、红肌肉型、肠炎型三种类型,红鳍红鳃盖型病鱼体色发黑,口腔、上下颌、头顶部、眼眶周围、鳃盖有出血点(图4-D,4-E)。
红肌肉型病鱼外表出血不明显,但剥去表皮可见肌肉呈现点状出血,甚至全身肌肉出血呈鲜红色(图4-F)。肠炎型则表现肠壁充血或出血,肠壁弹性较好,肠内无食物,黏液少,应注意与细菌性肠炎区分(图4-G)。组织病变可见骨骼肌纤维水肿、坏死,红细胞和炎性细胞浸润(图4-H);肝静脉上皮变性,和周围组织分离,胞浆内可见嗜酸性包涵体(图4-I);肾小管上皮细胞肿胀、空泡化、坏死, 官腔中有红细胞(图4-J)。
图4 草鱼患呼肠孤病毒感染
2.2.2 疱疹病毒:鲫鱼鳃出血
鲤科鱼类疱疹病毒病包括锦鲤疱疹病毒病、疱疹病毒性造血器官坏死病、鲤痘疮病,主要危害鲤科鱼类,且均会在鱼体表面产生疱疹样病变。其中,鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)又称疱疹病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis virus,HVHNV),能引起的金鱼和鲫鱼的一种高致病性疾病,会对脾、肾等造血器官产生严重破坏,体表严重出血,死亡率高达80%~100%,成世界范围流行,在我国,除有报道江苏异育银鲫感染CyHV-2外,其它地区还未有大规模暴发CyHV-2的文献记录。最早发现鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)的宿主是金鱼,1992年秋日本西部养殖场最早发现金鱼感染CyHV-2并引起大规模死亡,死亡率最高达到100%。随后,1995年台湾地区金鱼苗亦发生CyHV-2感染,通过电子显微镜检测到疱疹病毒颗粒。
1997年春季美国西岸地区金鱼苗种突发CyHV-2感染并引起死亡,后该病在美国大面积流行,死亡率超过80%。观赏鱼的国际贸易可能已经导致该病毒在全球范围内广泛分布。2002~2004年英国、澳大利亚、新西兰也有金鱼感染CyHV-2报道。鲫鱼作为金鱼的同种祖先是中国内陆地区主要食用淡水鱼之一。近年来,欧洲的匈牙利、捷克等国相继发现野生银鲫被CyHV-2感染并发生严重病害[34]。这是除金鱼外CyHV-2感染鲫鱼并引起爆发流行病害的最早报道。几乎与欧洲病害发生同时我国华东地区陆续发生了异育银鲫“鳃出血”病,并造成严重经济损失,其病原最终也被证实为CyHV-2。
鲫鱼鳃出血病会出现全身出血症状,尤以鳃部出血最为严重(图5-A,5-B),同时,通过免疫荧光技术能在自然发病鲫鱼鳃(图5-C,5-D)、肝(图5-E,5-F)、脾(图5-G,5-H)、肾(图5-I,5-J)等组织中观察病毒分布。
图5 鲤疱疹病毒2型感染
3 鱼类出血病防控关键技术
3.1诊断技术
3.1.1免疫学技术
免疫学技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应,检测病原微生物。目前,用于鱼类疾病诊断的免疫学技术主要有单克隆抗体技术、凝集反应技术、荧光抗体技术、酶免疫技术、胶体金技术等。其中,单克隆抗体技术是利用单抗的特异性、均一性、高效性来进行疾病的诊断,该技术具有快速、简单、灵敏度高的特点,但单克隆抗体的制备方法还有待改进。2013年,连科迅等制备了抗传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)单克隆抗体6G7,该抗体效价高、灵敏度高,特异性强,与天然抗原亲和力强,可用于传染性造血器官坏死病毒的快速诊断。
另外,荧光抗体技术是在免疫学、生物化学和显微镜的基础上建立起来的一项技术,该技术的优点是特异性强,敏感度高,但对仪器设备要求过高。鄢庆枇等在2006年应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的弧菌。酶免疫技术的方法很多,用于水产动物疾病诊断的主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)技术和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)技术。该方法具有操作简便,灵敏度高,可定量的优点。胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。运用较多的是胶体金免疫层析技术(GICA)和快速斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)。孟小林等在2007用免疫胶体金结合免疫层析法研制了一种快速检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)的试剂条。
3.1.2 分子生物学技术
鱼类疾病诊断的分子生物学技术有核酸杂交技术、PCR(聚合酶链式反应)技术、LAMP(环介导等温扩增)技术、限制性酶酶切检测技术、16S rRNA检测技术和基因芯片技术。
PCR技术是实验室进行鱼病诊断的常规技术和主流技术,用于疾病诊断及其衍生来的PCR技术有常规PCR、套式PCR、多重PCR等。而LAMP技术是一种新的核酸扩增技术,其反应速度快、操作简单,产物检测方便。张金凤等在2013年建立了逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测草鱼出血病病毒的方法,最低检测限为33pg,比PCR方法灵敏度高10倍。基因芯片技术是将大量探针分子固定于支持物上,根据碱基互补配对原理,与标记的样品分子进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。国内外都还处于起步阶段,仅用于诊断一些主要的细菌病和病毒病。
3.2 对症治疗措施
3.2.1 化学药物
虽然人们逐渐发现抗生素治疗非病毒性疾病会伴随环境污染、耐药性等副作用,并且随着科技的进步,出现了越来越多的非病毒性疾病治疗手段,并且终有一天会将其取代。但不可否认,目前抗生素疗法仍然是对抗非病毒性疾病,尤其是细菌病最有效的方法。当爆发细菌性出血病时,应在病原分离鉴定和药敏试验的基础上,在专业人员的指导下,合理、合法地使用抗生素。对于寄生虫性病原,可在合理使用敌百虫或其它类杀虫药进行驱虫。
3.2.2 中草药