近年来，有不少案例报道了通过物理参数实时评估(诸如温度分布、湿度分布、烟雾测试及浓度分布)及“计算机工程模拟技术”(CFD)对过氧*化*氢蒸汽灭菌的最不利位点进行研究。但是，其高昂的成本，复杂的数据分析让众多热衷于过*氧化*氢灭菌应用的终端使用者望而生畏。因此，通过分布较多的生物指示剂和化学指示剂进行工艺挑战以确定灭菌不利位点和灭菌致死率是比较主流的验证方法。
就生物指示剂挑战位点的数目而言：PDA第34号技术报告中提到，在隔离器腔体内部空间内，每平方米放置5~10个的生物指示剂是足够的。为了确认灭菌剂是否充分分布整个腔体，生物指示剂需充分分散放置在隔离器的表面上[2]。James Agalloco和James Akers[6]提到，就大型系统设备或区域而言(大于4?m3)，至少需要30个生物指示剂放置位点以进行灭菌验证，而就较小的体积的灭菌区域而言(小于1?m3)，10~15个生物指示剂验证位点是比较合适的，而体积大小介于两者的情况，25~30个生物指示剂是足够的。
灭菌工艺开发
几乎所有的过氧*化*氢灭菌设备或系统的供应商都可提供相应的灭菌工艺开发的辅助服务。然而，在国内众多的过*氧*化*氢灭菌应用案例中，“灭菌工艺开发”过程常被忽略并以所谓的“内部经验”取而代之。
不管选择何种灭菌剂或灭菌设备，以科学的测试方法评估和规范日常灭菌操作程序，并以此最终确立稳健的日常灭菌参数的过程是非常必要的。而灭菌工艺开发正是该规范化过程，目前，传统的主流灭菌工艺开发流程如下：a. 初始生物负载评估与分析：确立灭菌目标;b. 温度分布、气流分析、关键区域评估等：确立灭菌不利位点;c.化学指示剂分布、浓度分布、气流模拟等：确立气流分布特征;d.参数设置与D值测试：确立灭菌致死率和灭菌参数;e.参数优化与确认：灭菌挑战与性能确认;f. 通风与残留：安全评估。
许多学者主张使用“阴性分数法”以确定过*氧化*氢灭菌循环的灭菌致死率。执行阴性分数法的前提是保证灭菌工艺稳定，并且要求关键灭菌作用条件恒定。然而，对于现行的过氧*化*氢蒸汽灭菌工艺而言，在灭菌过程中，控制过*氧化*氢的气液平衡是非常困难的。因为，在灭菌过程中，温度，相对湿度、过氧化qing气体浓度、压力及过氧*化*氢凝结等都是不断变化的。正是如此，FDA并不十分支持此类通过测定D值以确立灭菌致死性能的做法。但是，而使用类似于在环氧乙烷灭菌验证中所用的“半周期法”以建立的过*氧化*氢灭菌循环时间的提议更是非常不可取的。因为通过此法所确立的灭菌循环的灭菌循环周期非常长。此外，由此方法所产生的安全和经济问题也是不可预知的。
虽然，严格控制过*氧化*氢关键灭菌变量在恒定的水平是不太现实的。但是，在相同的灭菌设备和灭菌区域、相同的灭菌环境及相同的灭菌参数条件下，获得一致的“灭菌作用模式”不是不可能的。现行的报告或文章提到，过氧*化*氢蒸汽灭菌过程是一个受多参数影响的物理及化学综合作用过程，其灭菌效力主要受过氧*化*氢浓度、温度、相对湿度、表面的过*氧*化*氢的凝结量影响[7]。因此，可通过控制过氧*化*氢蒸汽灭菌过程的气流参数以获得相对一致的“灭菌作用模式”。
尽管灭菌环境条件(温湿度)本身控制难度大，但是国际相关学者及相关论著提到环境条件本身对VPHP工艺的影响不是很大。Unger[8]等人较早对影响过*氧*化氢的杀孢子能力的灭菌条件进行研究，结果表明，汽态过*氧*化氢对微生物灭活的主要因素是在灭菌过程中在微生物表面所分布的水和过*氧*化氢分子，而气体中的过*氧*化氢浓度并不起关键性作用。
为了克服因灭菌工艺波动或者设备变数所造成的灭菌性能差异，许多学者建议在灭菌工艺开发所得到的灭菌暴露时间基础上增加20%。据2001 年ISPE所统计，在应用过氧*化*氢蒸汽对隔离器进行灭菌的483个案例中，通过使用孢子量为10^6的生物指示剂所验证的灭菌工艺都是合格的[9]。
“再验证”的注意事项
灭菌是保证无菌作业设备或系统的无菌性能的一个重要步骤，可通过使用生物指示剂对灭菌效果的再确认。如果在再验证过程中所使用的生物指示剂的抗性比“前验证”的生物指示剂抗性高，尽管灭菌工艺并没有改变，然而仍有可能会得到非预期的灭菌失败的结果。因此，在进行再验证之前，对挑战测试的生物指示剂的抗性进行测试和评估，并因此对灭菌的预期目标(期望)进行相应的调整，然后再执行再验证是比较科学的做法。
过*氧*化氢灭菌应用的相关问题
材料兼容性与腐蚀
作为一种强化学作用的化学物品，过*氧*化氢*的腐蚀性一直是一个“老生常谈”的问题。除尼龙、碳钢、环氧树脂彩钢板、塑钢以及部分橡胶(乳胶橡胶、ding腈橡胶、氯丁橡胶等)等材*料外，过*氧*化氢蒸汽可与大多数材料良好兼容。
在某些特定条件下，过氧*化*氢凝结的多少和作用时间的长短影响着灭菌的效果。但是，高浓度的过氧*化*氢凝结及作用时间关联着灭菌表面材质的腐蚀问题。故在灭菌工艺的开发过程中，需要权衡和协调凝结量(时间)与灭菌效果的平衡。而采用过度杀灭法所确立的灭菌循环的作用时间和剂量都远远超出实际所需，正是如此，因过度灭菌所给材质带来的腐蚀或者影响是大大增
加的。
残留与安全
许多过*氧*化*氢灭菌系统的使用者都比较担心过氧*化*氢的残留对人、工艺、产品及使用设备的影响，因此要求对过*氧化*氢灭菌残留进行验证。作者认为，对于遗留在与药品直接接触的材料的灭菌剂残留而言，残留水平是必需鉴定的。然而，就不与药品直接接触的表面进行净化处理而言，一定限度的过氧*化*氢残留并非会对依赖于产品特性的“无菌作业”产生多大的影响。因此，不必“过分纠结”遗留在不与药品直接接触的材料上过氧*化*氢
残留。
就职业危害和人员安全而言，现行的美国职业安全及健康管理署对过氧*化*氢的“允许暴露浓度值”要求为8?h“加权平均值”低于1?ppm(或表述为1.4 mg/m3)。与此类似，美国国家职业安全与健康研究所推荐过氧*化*氢的“暴露浓度值”要求为10?h(40?h/周)“加权平均值”低于1?ppm。此外，就污染安全排放标准而言，美国国家工业卫生学家会对过氧*化*氢的“污染排放临界值”定义为1?ppm。
