得益于基因编辑技术的深入研究，基因治疗得到了快速发展。越来越多在单基因遗传病，恶性肿瘤，心脑血管及神经系统的领域的疾病通过基因疗法得到控制和治疗。在2021年1月19日，CDE正式受理纽福斯生物的AAV基因治疗“NR082眼用注射液”，从这之后AAV基因治疗领域就掀起了一股热潮。以纽福斯生物（申报首款AAV基因治疗）、信念医药（申报首款全身AAV基因治疗）两家为开端，现在已经有多款产品申报/获批临床。其中利用AAV的基因治疗在眼科和罕见病领域成果显著，目前已获批上市的三款AAV基因治疗药物均包含在内。
基因治疗的关键是使用安全有效的基因递送载体。病毒载体是常用的基因导入的方式之一。而腺相关病毒载体由于转基因效率高，安全性好，在基因治疗领域有着广泛应用。
在医麦客刚刚举办的以“蓄力前行，助力新生”为主题的2021 CSGCT基因与细胞治疗医学峰会上，我们有幸邀请到派真生物创始人李华鹏博士做客峰客访谈栏目并就AAV载体的规模化生产和派真生物的战略规划展开话题。
李华鹏博士是美国麻省大学医学院基因治疗中心博士后，从事基因治疗研究十余年，致力于重组腺相关病毒(rAAV)生产产业化和病毒载体创新。在麻省大学研究AAV的生涯中李华鹏发现，限制基因治疗领域发展的主要原因之一就是基因治疗载体的产能供应不足。为了弥补这方面的空白，李华鹏博士决定成立派真生物(PackGene Biotech)搭建能够突破产能瓶颈，助力行业发展的AAV生产工艺平台。
派真生物现已拥有符合NMPA/FDA/EMA标准的8000平方米GMP厂房、亚洲首个4000L产能的临床级AAV生产基地，能够为细胞与基因治疗 (CGT) 的早期研发、临床前开发、临床试验以及药物审批提供经济、快速、规模化的质粒生产和AAV病毒载体生产、检测，客户分布超过二十个国家，与超过200家药物研发企业及数百家科研院所建立起紧密合作。
π-Alpha AAV高产平台
以创新突破产能壁垒
在基因治疗产业对载体的需求量日益加大的同时，AAV的规模化生产成了限制进程的枷锁。对于AAV而言，研发的过程中空衣壳、宿主基因组残留等问题都是需要关注的风险点，在工艺放大后这些问题的表现则更为突出。
在AAV载体的制造过程中采用最多的就是经典的三质粒共转染法(Helper-free AAV包装系统)，涉及将如下三个质粒共转染到HEK293细胞中，然后从细胞裂解物和培养基中分离纯化rAAV。FDA批准的首个治疗先天性黑朦病的基因药物Luxturna (Spark Therapeutics)，以及脊髓性肌萎缩症SMA的基因药物Zolgensma （Novartis）就是基于该方法所开发。
1.AAV-GOI：含有目的基因(GOI)的含AAV反向末端重复序列(ITR)的质粒；
2. AAV-RC：带有AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因的AAV血清型质粒；
3.pHelper：AAV辅助质粒，提供从腺病毒中分离的辅助基因。
但有时AAV不能正确的进行组装从而形成内部没有所需基因组片段的空外壳，也因此在所需计量加大后使患者会被注入数万亿个不必要的外来蛋白质，从而带来安全上的隐患。如何在高产的同时又要降低空壳率成了AAV产商面临的挑战。另外还会有来源于宿主细胞基因组的DNA可能会错误包装进入AAV，称为AAV衣壳内HCD残留，也逐渐引起更多安全性上的关注。
为了降低空壳率和杂质，提高病毒滴度，派真生物逐渐建立和完善了五大技术平台。其中最核心的就是π-AlphaTM293细胞AAV高产平台。
“π-AlphaTM293细胞AAV高产平台主要是结合AAV生产上下游一体化体系进行优化，利用独特设计的辅助RC质粒，同时结合关键工艺参数DOE实验优化，可将悬浮293生产体系总产率提高10倍以上。目前最高达到9×10^11vg/ml以上的裂解液滴度，在降低空壳率、提升感染滴度的同时，极大降低关键杂质(HCD， 内毒素等)的含量。”
据悉，在广谱型提高各种AAV血清型的生产效率方面，派真生物基于其自主知识产权的高产AAV质粒核心技术平台，针对不同血清型的生产工艺平台，能在多种血清型AAV例如AAV5和AAV9 上获得3-8倍的增产，让AAV药物研发企业的产品在商品化生产时成本大大降低。
“目前，我们在200L悬浮293细胞AAV实际生产上实现高达7.3E+16vg 总裂解产量，回收率超过30%。这个技术平台涉及十多项发明专利，6项已经授权，多项正在申请，还有属于商业机密的部分。”
“HCD，细胞宿主基因组残留，是近期FDA和申报IND的基因治疗研究者都比较关注的一个点，特别是在静脉注射的应用上。因为静脉注射剂量高，总杂质含量更高，引起更多的安全性顾虑。我们经过大量的实验发现，HCD残留杂质的降低不像早期所认为的主要在下游改进就行。它是一个系统性的问题，涉及上游和下游全方位，一些关键条件的变化会大幅影响HCD杂质含量。通过我们基础研究和工艺研究两部门的通力合作，目前我们已经做到了把原来生产体系里的HCD杂质降低了四十倍以上的水准。”
高库容量AAV筛选技术平台
血清型上再做突破
在另一方面，派真生物也在积极寻找更优质的AAV血清型。李华鹏表示：“我们一直认为，找到感染力更强、使用剂量更低的AAV血清型，既可以大幅降低生产成本，也可以降低高剂量注射带来的潜在毒性和副作用。多年前就开始了研究突变体建库以及筛选的系统，经过不断改进和打磨，三代的更新，目前已经有很好的产出，新的高效突变体血清型正在申请专利。希望帮助更多基因治疗研发企业，使基因药尽快从研发进入临床，并最终推上市场，让老百姓能真正受益。”
据公司网站披露，在AAV靶向性的研究上，派真生物已和神济昌华、华深制药达成合作。李华鹏表示:“我们跟神济昌华以及华深智药的合作是因为能各取所长，促进我们战略目标的达成。神济昌华的贾谊昌教授的团队在渐冻症ALS方面成就在国内享有声誉，在神经系统研究方面有很深的积累，而派真希望在神经系统上做更深入的AAV血清型筛选或者创新工具的开发，两个团队深度互补，共同开发靶向神经系统新型AAV 衣壳。华深智药的彭健教授团队在人工智能AI应用于大分子的优化上有非常扎实的基础和丰富经验，派真将基于自有AAV高产体系的高库容量、高精准度的AAV突变库筛选平台，结合华深智药专有的AI平台和技术，共同开发可满足特定疾病转导特征的新型AAV衣壳。通过工程化平台对衣壳进行优化，生成靶向特定组织类型的AAV，并且限制与目标疾病无关的组织和细胞类型的转导，从而提高疗效和安全性。”
“AAV载体是最安全，也是目前最有效的载体，但在剂量、组织特异性、用药后免疫原性等方面还有很多改进的空间，因此派真对AAV载体目前的优化除了外壳以外，在表达元件、编码序列方面，都在大量投入研发。作为平台，我们希望能推出更多的载体工具，让整个领域的客户受益。”李华鹏补充道。
以“工匠”精神做企业
以“创新”精神向未来
派真生物是如何一步一步走到如今行业领先的，李华鹏博士向我们说了这样一段话：“派真成立至今能够做到现在的规模，我想关键应该是我们以创新技术平台为导向，以解决问题为导向的定位。派真发展的过程，就是以解决基因治疗领域的痛点、解决生产工艺问题为导向的发展过程，通俗地说，是以工程师思维去做事情，以工匠精神精益求精解决问题。从派真创立开始，我的目标就是提升AAV产量和优化生产工艺。等到这些技术目标达到一个水平，确认我们在这方面有了自己的优势，我们才开始下一步解决商业运营的问题。一路的发展过程，也就是一个个问题的解决过程。”
“目前为止，我们一步步解决了多个质粒和AAV工艺上的关键问题，同时建成了国内最为全面的AAV和质粒检测平台，不但满足自己的AAV生产质检需要，还为其他的基因治疗公司提供检测服务，助力他们成功完成IND申报。这些的关键都在于技术的驱动。另外，我们吸引了CDMO生产工艺开发、药品生产体系、药物申报方面具有多年经验的资深专家加入，以确保我们能稳妥交付CDMO的订单。但需要强调的是，公司的成功不能只靠技术，还需要有运营、市场，商务和财务等各方面的资深专家同事加入，缺了哪一块，都没办法长期持续发展。我们一直在积极加强这些方面的团队建设，一个全方位、高层次、国际化、专业化的人才队伍是我们持续追求的目标。欢迎有意愿、有激情、有能力的人联系我们。”
作为亚洲领先的AAV CDMO企业，派真生物的客户类型囊括国内外的大型医药公司以及国内的初创公司和科研院校。
无论是载体的大规模批量生产还是客户所需求的量身定制，派真已经建立起一站式一体化的服务平台。“派真很大一部分CDMO客户都因为体验到了CRO服务的高质量和高效率，而再继续使用我们的CDMO服务。无论哪种类型的客户，我们都希望能全方位帮忙，为其提供从创新研发到IND申报、临床样品生产，再到商业化生产的基因治疗药物开发的一站式服务，从而帮客户实现降本增效，帮助客户提高药品上市的效率，增加产品的市场竞争力。最终实现‘让老百姓用得起基因治疗’的使命。”李华鹏博士说道。
持续深耕，全力打造基因治疗
CDMO领域的民族品牌
在基因治疗的蓬勃发展之下，除了AAV，慢病毒、VLP、LNP等多种递送系统迎来了发展的“春天”，递送载体的多元化渐渐成为一种趋势。李华鹏说到:“未来递送系统多元化是可能的，很难想象一种载体能满足全部医学应用的需求。我们所知AAV的优点在于安全性、感染的广谱性及长期药效稳定性，但也有应用可能更需要短期表达、或者能携带更长的治疗序列、能多次用药等，目前AAV还没能满足，因此发展其它种类的载体也是存在强需求的。但一个全新载体的开发会经历较长时间，比如AAV、LNP+mRNA，也经历了几十年的发展。我对各类载体的看法是，如果它们能做到安全、有效，还能做到AAV载体目前所不能做到的，必然就会有发展的空间。派真是基因治疗载体的CRO和CDMO，我们对递送系统没有偏向性，只要是客户需要的，我们都会根据资源情况，尽可能满足。”
AAV尽管已经在基因治疗技术中广泛被运用到，但在表达时长方面、多次用药的需求上、递送序列长度的限制上都有待发展的空间。我们期待着多元化递送系统的局面出现，也期望着AAV领域的不断发展能够克服现阶段基因治疗面临的难关。
“接下来，我们将持续深耕质粒和AAV临床级别生产领域，加快新型血清型载体及高产AAV技术开发，不断提高AAV及质粒的产量、质量、有效性和安全性，解决AAV生产中成本高、关键设备和物料高度依赖进口等卡脖子问题，争做质粒和AAV CDMO领域的领头羊。同时，我们将优化国际市场布局，全力打造基因治疗CDMO领域的民族品牌。”
